《消毒剂与抗抑菌剂中激素的检测方法和评价要求》标准解读

一、标准制修订的背景

激素（Hormones）最早由英国生理学家Starling于1902年发现促胰液素后，于1905年确立，当时激素专指在生理状态下，有某些组织细胞产生，弥散进入组织，通过血液循环到达机体的远处组织，发挥特殊生理作用的一类化学物质。后来又提出神经激素、局部激素等术语，可见激素的概念越来越广泛。但近几年对激素的定义，一般描述为：内分泌腺或内分泌细胞分泌的高效化学物质称为激素，它作为化学信使经体液传递到达靶细胞，活化或抑制其固有的反应，以调节其生理功能（《药物名词》）。按药物类别来分，激素可分为糖皮质激素、肾上腺皮质激素、去甲肾上腺激素、性激素（孕激素、雌激素、雄激素）等。原卫生部《消毒产品生产企业卫生规范》（2009年版）第五章第三十条明确指出消毒产品禁止使用抗生素、抗真菌药物、激素等物料。但部分生产企业仍然违规添加激素类药物，增加消毒或抗炎效果，用于冒充消毒产品和抗抑菌产品，不仅加重我国激素类药物的滥用情况，延误患者治疗时机，也给消毒和抗抑菌产品的安全使用造成隐患。为打击消毒产品冒充药品行为，原卫生部多次组织专项整治行动，打击违法添加行为，由于没有完善的方法和相应的国家标准，目前仍然无法对相关产品进行有效监管。2019年的神夫草事件以及2021年初的大头娃娃事件等等，都是消毒产品中违法添加了激素导致人员健康受到损害。因此，需尽快制定相关标准，打击违法行为。

二、标准发布的重要意义

本标准的出台规定消毒剂与抗抑菌剂中激素的检测方法和评价要求，弥补了国家尚无相关标准的空缺，尤其为市场监管部门打击违法添加行为提供技术支撑，为保障人民健康保驾护航。

三、重要指标的制定依据

标准中各项重要技术指标依据如下。

1.目标物的选择皮肤黏膜外用类激素类药物主要涉及糖皮质激素，剂型多为液体剂、凝胶剂、膏霜剂。由于消毒产品与抗抑菌产品中，经常违规添加激素类药物的主要是用于皮肤黏膜消毒和抗炎，综上考虑，本标准的激素类药物选择以皮肤黏膜外用类糖皮质激素为主要参考。

2009年与2010年原卫生部两次发文中涉及到7种糖皮质激素，在全国消毒剂与抗抑菌产品督查检测中有所发现（检出5种糖皮质激素），本标准已全部（7种）吸收纳入并进行方法改善，相关文献报道在消毒产品中检出地塞米松、曲安奈德、丙酸氯倍他索。为了了解目前市售消毒产品中激素的非法添加的情况，项目组依托江苏省、安徽省、黑龙江三省委托检测的抽检样品，采用超高效液相色谱-四级杆串联时间飞行质谱仪，对78种膏霜剂型、5种液体剂型、7种凝胶剂型，共计90份样品中可能违法添加的激素进行了初步筛查，共检出丙酸氯倍他索、地塞米松、倍他米松、曲安奈德、醋酸地塞米松、泼尼松、异氟泼尼松，检出一种或以上激素的样品达到23.5%，其中丙酸氯倍他索检出率最高，达到15.2%。同时依据《化妆品中四十一种糖皮质激素的测定 液相色谱/串联质谱法和薄层层析法》（GB/T 24800.2-2009）以及《化妆品中七种性激素的测定 超高效液相色谱-串联质谱法》（GB/T 34918-2017）的前处理方法，通过优化方法，本文件涵盖了原卫生部两次发文的7种糖皮质激素、文献报道检出的3种糖皮质激素以及本项目组通过对90份市场抽检样品筛查出的7种糖皮质激素，其中文献报道检出中的2种糖皮质激素以及本项目组筛查出的4种糖皮质激素与原卫生部两次发文的7种糖皮质激素存在交集，故而，本文件最终规定了11种糖皮质激素的检测方法。

2.色谱条件的选择2.1 流动相的选择通过比较水-甲醇体系以及水-乙腈体系，发现水-乙腈体系下各目标物的分离以及响应更好，因此本实验采用水-乙腈作为流动相。

2.2 梯度条件的选择通过改变梯度条件，可改善目标的分离程度，倍他米松和地塞米松为一对同分异构体，化学性质接近。从不同洗脱程序下同分异构体的分离情况，可以看出，虽然梯度时间增加了一倍，但倍他米松和地塞米松只是整体保留时间后移，而分离程度并没有明显的改善，并且采用16 min的梯度程序，同分异构体已基线分离，因此，本实验梯度程序选用16 min的洗脱程序，大大节约了分析时间，又能满足实验要求。

3. 样品前处理条件的选择

根据《消毒产品中糖皮质激素（glucocorticoid）测定-液相色谱-串联质谱法》、《消毒产品中丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星测定-液相色谱-串联质谱法》《化妆品中四十一种糖皮质激素的测定 液相色谱/串联质谱法和薄层层析法》（GB/T 24800.2-2009）以及《化妆品中七种性激素的测定 超高效液相色谱-串联质谱法》（GB/T 34918-2017）的相关前处理内容，结合项目组已发布的标准《消毒剂与抗抑菌剂中抗菌药物检测方法和评价要求》（WS/T 684-2020）中的相关内容，项目组初期选定了57种糖皮质激素和17种性激素，共计74种激素进行方法学实验，分别比较了两种前处理方法：

第一种：称取1g空白基质样品，按照低、中、高以及不加标（即空白实验）四种水平进行加标实验，各加标样品中均加入同位素内标，再分别加入5mL水和10mL乙腈，涡旋10min，加入10%K4Fe(CN)6和20%的ZnAC2各0.2 mL，涡旋1min，加入盐包，涡旋5min，在-2 ℃下，10000 r/min离心5 min，取1.5 mL上清液转移至净化管中（含20mg GCB，100mg PSA，100 mg C18，150 mg硫酸镁），涡旋1min，12000 r/min离心5min，取0.8 mL上清液吹干，最后用0.4 mL20%乙腈水溶液复溶，上机检测（膏剂样品比较过膜影响）。

第二种：前处理过程基本与第一种一致，除净化管中填料的比例不同外（第二种方法中填料的比例：7.5mg GCB，50mg PSA，50 mg C18，150 mg MgSO4），另外，在处理膏剂基质的时候，加入盐包前又加入了1g的EMR填料，其余过程均与第一种方法一致。

实验结果：对于水剂和凝胶两种基质，两种处理方式均能得到澄清的提取液，经过净化处理后，复溶液均澄清透明；而对于膏剂样品，第一次无法获得澄清的提取液，而第二次加入EMR填料后能获得较澄清的提取液。对于膏剂样品，若复溶后不过膜，样品不澄清，但是过膜后，发现醋酸氟氢可的松、雌二醇、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚、环索奈德、己烯雌酚-D8基本无响应，推测膜对该几种物质有吸附作用；黄体酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羟孕酮等四种物质过膜后响应变强，不过膜基本不出峰；部分目标物存在过膜后绝对响应有所降低，但均能满足实验需求，且过膜后绝大多数目标物的回收率要优于不过膜时的结果。从三种基质的整体回收率结果来看，第一种方法要优于第二种方法，这主要是第一种方法中的净化填料较多，能更好的去除杂质，因此结果更加满意。

丙酸睾酮在三种基质中回收率均较低（25%-50%，膏剂中最差），戊酸双氟可龙、甲羟松、己酸羟孕酮在膏剂中回收率较差，盐酸去氧肾上腺素回收率差。综上考虑，本方法删除醋酸氟氢可的松、环索奈德、戊酸双氟可龙、甲羟松4种糖皮质激素、盐酸去氧肾上腺素以及雌二醇、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚、丙酸睾酮、己酸羟孕酮6种性激素，最终，本方法涵盖了52种糖皮质激素和11种性激素，共计63种激素。最终样品的前处理方法为：

a) 液体剂型和凝胶剂型

称取1.0 g（精确至1 mg）混合均匀的样品，置于50 mL离心管中，先加入10.0 μL混合内标化合物标准中间液，再分别加入5 mL水和10 mL乙腈，涡旋提取10 min，加入10%K4Fe(CN)6和20%的C4H6O4Zn各0.2 mL，涡旋5 min，加入盐析剂，涡旋5 min，10000 r/min离心5 min，取1.5 mL上清液转移至基质分散固相净化管中，涡旋1min，12000 r/min离心5 min，取0.8 mL上清液吹干，最后用0.4 mL乙腈水溶液复溶，上机检测。

b) 膏霜剂型

称取1.0 g（精确至1 mg）混合均匀的样品，置于50 mL离心管中，先加入10.0 μL混合内标化合物标准中间液，再分别加入5 mL水和10 mL乙腈，涡旋提取10 min，加入10%K4Fe(CN)6和20%的C4H6O4Zn各0.2 mL，再加入1 g EMR净化填料，涡旋5 min，加入盐析剂，涡旋5 min，将离心管置于-20 ℃冰箱中静置30 min后以10000 r/min离心5 min，取1.5 mL上清液转移至基质分散固相净化管中，涡旋1min，12000 r/min离心5 min，取0.8 mL上清液吹干，最后用0.4 mL乙腈水溶液复溶，过膜，上机检测。

4.基质效应的考察

基质效应在液质联用技术中普遍存在，主要是由于共提取物与目标分析物在电喷雾离子源上存在竞争效应，通常以基质抑制效应为主。本研究将不含目标分析物的空白基质按样品前处理方法获得空白基质溶液，用该基质溶液稀释混合标准使用液，用该基质标准液中各目标物的响应值与纯溶剂稀释所得的同浓度标准液的响应值进行比较，从而评估目标物的基质效应。当比值大于100%时，表现为基质增强效应，反之，则为基质抑制效应。液体剂型：22.9%-110.6%，3/74小于40%，5/74在52%-58%之间，15/74在67%-80%之间，51/74在80%-110%之间，绝大多数目标物基质效应较小，方法基质去除效果较好。凝胶剂型：除63号目标物无法计算外，其余73种目标物基质效应在27.5%-127.4之间，4/73小于75%，其余均高于80%，整体结果较好，基质效应影响小。膏霜剂型：4个目标物无法计算，其余70种目标物在0.6%-146%之间，17/70小于40%，12/70在40%-80%之间或大于140%，其余41/70在80%-127%之间，膏剂的基质抑制效应较明显，但能满足方法检出限和定量要求。

5.定量方式的确定

由于膏霜类、液体类和凝胶类消毒剂与抗抑菌剂的成分比较复杂，基质干扰严重，各目标物质受基质抑制效应明显，当采用外标法进行定量时，无论是采用标准曲线法或者是基质加标曲线法，各目标物质的回收率都较低，在30%-60%范围内，因此不能满足实验需求。虽然内标较为昂贵，但是能很好的校正各目标物质的浓度，因此本方法最终选用了内标法进行定量。

四、征求意见和采纳情况

本标准由国家卫生健康委提出并归口。本标准于2020年立项并于8月正式下达，为制订项目，编号为20201701。由江苏省疾病预防控制中心负责起草。征求意见表共发出56份（其中委员20名，非委员26名，企业10家），有效回收56份， 共收到意见 159条（含无意见5条），其中99条采纳，7条部分采纳，48条不予采纳，不采纳意见的理由见征求意见汇总表。各位专家对本标准征求意见稿的意见主要集中在标准名称、限量要求、术语、单位符号等。标准起草单位逐条进行了修改完善。